Licht für die Netzhaut
AFB I–IIBei der erblichen Netzhautdystrophie durch Mutationen im Gen RPE65 (autosomal-rezessiv) fehlt ein Enzym, das der Sehfarbstoff nach jedem Lichtreiz zur Regeneration braucht. Betroffene sehen schon als Kinder nachts schlecht und erblinden meist bis zum Erwachsenenalter. Seit 2018 ist in der EU das Gentherapeutikum Luxturna zugelassen.
Ein adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sich nicht mehr vermehren kann, trägt eine intakte Kopie der codierenden Sequenz von RPE65 (etwa 1,6 kb) mit einem Promotor. Bei einer Augenoperation werden die Viren unter die Netzhaut gespritzt. Sie dringen in die Pigmentepithelzellen ein; die Genkopie bleibt im Zellkern neben den Chromosomen. Die Pigmentepithelzellen teilen sich im Erwachsenen praktisch nicht mehr.
| Merkmal | AAV | Lentivirus |
|---|---|---|
| Einbau ins Genom | nein, meist episomal | ja, an zufälligen Stellen |
| Transportkapazität | ca. 4,7 kb | ca. 8 kb |
| geeignet für | sich nicht teilende Zellen | sich teilende Zellen |
| typischer Einsatz | in vivo | ex vivo |
- Beschreiben Sie das Prinzip der Behandlung mit Luxturna (M1).
- Erläutern Sie, warum ein AAV für diese Behandlung besonders geeignet ist (M1, M2).
- Vergleichen Sie diese Behandlung mit einer Gentherapie, bei der Blutstammzellen ex vivo mit einem Lentivirus verändert werden (M2).
- Ein erfolgreich behandelter Patient fragt, ob seine Kinder nun gesund sein werden. Seine Partnerin ist nicht Anlageträgerin. Begründen Sie Ihre Antwort.
Hinweise
Hinweis zu Aufgabe a)
Hinweis zu Aufgabe b)
Hinweis zu Aufgabe c)
Hinweis zu Aufgabe d)
Erwartungshorizont
Erwartungshorizont zu Aufgabe a)
Die Therapie ist eine somatische Gentherapie in vivo durch Genaddition: Ein nicht vermehrungsfähiges AAV dient als Vektor und bringt eine intakte RPE65-Kopie direkt in die Pigmentepithelzellen der Netzhaut. Dort wird die Genkopie transkribiert und translatiert, die Zellen bilden das fehlende Enzym. Das defekte Allel bleibt im Genom unverändert.
Erwartungshorizont zu Aufgabe b)
Die RPE65-Sequenz ist mit etwa 1,6 kb klein genug für die Kapazität des AAV (ca. 4,7 kb). Da sich die Pigmentepithelzellen nicht mehr teilen, geht die episomale Genkopie nicht durch Zellteilungen verloren — sie muss nicht ins Genom eingebaut werden. Der fehlende Einbau vermeidet das Risiko, dass ein Vektor ein anderes Gen zerstört oder aktiviert. Außerdem erreicht man die Netzhaut gut direkt, eine Behandlung in vivo ist also möglich.
Erwartungshorizont zu Aufgabe c)
Gemeinsam: somatisch, Genaddition mit viralem Vektor. Unterschiede: Blutstammzellen werden entnommen und im Labor behandelt (ex vivo), die Netzhaut wird im Körper behandelt (in vivo). Blutstammzellen teilen sich ständig; eine episomale AAV-Kopie würde verdünnt, deshalb nutzt man Lentiviren, die die Genkopie ins Genom einbauen, sodass alle Tochterzellen sie erben. Nachteil des Lentivirus: Einbau an zufälligen Stellen kann Gene stören (Insertionsmutagenese).
Erwartungshorizont zu Aufgabe d)
Der Patient ist homozygot (aa); die Behandlung hat nur Netzhautzellen verändert, nicht die Keimbahn. Jede Samenzelle enthält weiterhin ein defektes Allel a. Mit einer Partnerin AA sind alle Kinder Aa: Sie erkranken nicht, sind aber sämtlich Anlageträger. Gesund sind sie also wegen der Partnerin, nicht wegen der Therapie.
Fetales Hämoglobin statt Sichelzellen
AFB II–IIIBei der Sichelzellkrankheit verklumpt verändertes Hämoglobin (HbS) bei Sauerstoffmangel; die roten Blutzellen verformen sich zu Sicheln und verstopfen Kapillaren. Schmerzhafte Gefäßverschlusskrisen sind die Folge. Menschen, die als Erwachsene weiter viel fetales Hämoglobin (HbF) bilden, haben kaum Beschwerden. Darauf beruht die CRISPR-Therapie Casgevy.
Ausschnitt aus einem Strang einer Ziel-DNA:
5′-TTGCATGACCTGAAGCTCATCGAGGACTGG-3′
Leitsequenz der Guide-RNA: 5′-GCAUGACCUGAAGCUCAUCG-3′. Cas9 bindet nur, wenn direkt 3′ hinter der Zielsequenz (im gezeigten Strang) die PAM 5′-NGG-3′ liegt, und schneidet beide Stränge drei Basenpaare vor der PAM.
| Zeitpunkt | HbF-Anteil am Hämoglobin | Gefäßverschlusskrisen pro Jahr | editierte Allele in Blutzellen |
|---|---|---|---|
| vor der Behandlung | 5 % | 3,9 | 0 % |
| 3 Monate danach | 38 % | — | 85 % |
| 6 Monate danach | 43 % | — | 87 % |
| 12 Monate danach | 44 % | 0 bei 29 von 30 Patienten | 88 % |
Das Gen BCL11A codiert einen Transkriptionsfaktor, der nach der Geburt die Gene der γ-Globin-Ketten (Bestandteil von HbF) reprimiert. In roten Vorläuferzellen wird BCL11A über einen Enhancer aktiviert, an den der Transkriptionsfaktor GATA1 bindet. In anderen Zellen, z. B. Nervenzellen, wird BCL11A über andere Kontrollelemente gesteuert und ist dort lebenswichtig. Casgevy schneidet mit Cas9 an der GATA1-Bindestelle dieses Enhancers; die Schnittstelle wird durch NHEJ repariert.
- Ermitteln Sie in M3 die Zielsequenz, die PAM und die Schnittstelle. Geben Sie an, mit welchem DNA-Strang die Guide-RNA paart.
- Erklären Sie, wie die Behandlung zu einem höheren HbF-Anteil führt, und begründen Sie, warum gezielt der Enhancer und nicht die codierende Sequenz von BCL11A geschnitten wird (M5).
- Werten Sie die Daten in M4 aus.
- Beurteilen Sie Chancen und Risiken dieser Therapie im Vergleich zu einer Korrektur der Sichelzell-Mutation per HDR.
Hinweise
Hinweis zu Aufgabe a)
Hinweis zu Aufgabe b)
Hinweis zu Aufgabe c)
Hinweis zu Aufgabe d)
Erwartungshorizont
Erwartungshorizont zu Aufgabe a)
Mit T statt U lautet die Leitsequenz GCATGACCTGAAGCTCATCG; sie steht im gezeigten Strang ab der 3. Base: 5′-TTGCATGACCTGAAGCTCATCGAGGACTGG-3′.
Direkt dahinter folgt AGG = NGG, also die PAM. Geschnitten wird drei Basenpaare vor der PAM: GCATGACCTGAAGCTCA | TCG.
Da die Leitsequenz dieselbe Basenfolge wie der gezeigte Strang hat, paart die Guide-RNA komplementär und antiparallel mit dem Gegenstrang.
Erwartungshorizont zu Aufgabe b)
Durch den Schnitt und die fehleranfällige Reparatur per NHEJ entstehen kleine Insertionen oder Deletionen in der GATA1-Bindestelle. GATA1 kann nicht mehr binden, der Enhancer aktiviert BCL11A in roten Vorläuferzellen nicht mehr. Ohne den Repressor BCL11A werden die γ-Globin-Gene wieder transkribiert, es entsteht HbF (α₂γ₂), das keine β-Ketten enthält und deshalb nicht verklumpt; es verdünnt zudem HbS. Den Enhancer statt der codierenden Sequenz zu treffen, schaltet BCL11A nur in roten Vorläuferzellen aus — in anderen Zellen, etwa Nervenzellen, wo das Protein lebenswichtig ist, bleibt es erhalten, weil der Enhancer gewebespezifisch wirkt.
Erwartungshorizont zu Aufgabe c)
Vor der Behandlung liegt der HbF-Anteil bei 5 %, die Patienten haben im Mittel fast vier Krisen pro Jahr. Schon nach 3 Monaten sind rund 85 % der Allele editiert, der HbF-Anteil steigt auf 38 % und bleibt ab 6 Monaten stabil bei gut 40 %. Nach 12 Monaten sind 29 von 30 Patienten frei von Krisen. Der stabile Anteil editierter Allele zeigt, dass sich die veränderten Stammzellen dauerhaft im Knochenmark angesiedelt haben. Da nicht 100 % der Allele editiert sind, besteht ein Mosaik aus veränderten und unveränderten Zellen; der HbF-Anteil reicht dennoch aus, um Krisen fast vollständig zu verhindern.
Erwartungshorizont zu Aufgabe d)
Chancen: Eine einmalige Behandlung beseitigt die Krisen bei fast allen Patienten (M4); NHEJ ist in Stammzellen effizient, und es genügt eine Zerstörung der Bindestelle — dafür ist keine Vorlage nötig. Eine HDR-Korrektur wäre eleganter (Ursache statt Umweg), ist aber in Blutstammzellen deutlich weniger effizient.
Risiken: Off-Target-Schnitte an ähnlichen Sequenzen, unerwünschte größere Deletionen am Schnitt, ein Mosaik unveränderter Zellen; die Busulfan-Chemotherapie kann unfruchtbar machen und birgt Infektions- und Krebsrisiken. Die Mutation bleibt erhalten und wird vererbt. Sehr hohe Kosten und aufwendige Spezialkliniken begrenzen den Zugang — gerade dort, wo die Krankheit am häufigsten ist (Afrika südlich der Sahara), eine Frage der Gerechtigkeit.
Urteil (Beispiel): Für schwer Erkrankte ohne passenden Stammzellspender überwiegen die Chancen; als Standardtherapie für alle ist sie wegen Belastung und Kosten derzeit nicht geeignet.