Eine PCR planen
AFB I–IIEin Labor soll einen 412 Basenpaare langen Abschnitt eines Gens vervielfältigen. M1 zeigt das Temperaturprogramm des Thermocyclers, M2 den Zielabschnitt und vier angebotene Primer.
| Schritt | Temperatur | Dauer | Wiederholungen |
|---|---|---|---|
| Start-Denaturierung | 95 °C | 2 min | 1× |
| Denaturierung | 95 °C | 30 s | 30× |
| Primer-Anlagerung | 58 °C | 30 s | 30× |
| Elongation | 72 °C | 45 s | 30× |
| Abschluss-Elongation | 72 °C | 5 min | 1× |
| Aufbewahrung | 4 °C | bis zur Entnahme | – |
Zielabschnitt, nur ein Strang gezeigt (Anfang und Ende):
5′-TCAGGATCCA … GGTACCTTAG-3′
Angebotene Primer (verkürzt auf 10 Nucleotide):
P1 5′-TCAGGATCCA-3′ · P2 5′-AGTCCTAGGT-3′
P3 5′-GGTACCTTAG-3′ · P4 5′-CTAAGGTACC-3′
- Beschreiben Sie die molekularen Vorgänge in den drei Schritten eines Zyklus (M1).
- Erläutern Sie, warum für die PCR die Taq-Polymerase und nicht eine DNA-Polymerase aus menschlichen Zellen verwendet wird.
- Bestimmen Sie mithilfe von M2 das geeignete Primerpaar und begründen Sie Ihre Wahl.
- Nach 30 Zyklen besteht das Produkt fast ausschließlich aus Doppelsträngen von genau 412 bp Länge. Erklären Sie diesen Befund.
Hinweise
Hinweis zu Aufgabe a)
Hinweis zu Aufgabe b)
Hinweis zu Aufgabe c)
Hinweis zu Aufgabe d)
Erwartungshorizont
Erwartungshorizont zu Aufgabe a)
Denaturierung (95 °C): Die Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen lösen sich, die Doppelstränge trennen sich in Einzelstränge. Primer-Anlagerung (58 °C): Beim Abkühlen paaren die beiden Primer über Wasserstoffbrücken komplementär und antiparallel mit ihren Zielstellen, je einer am 3′-Ende der Zielsequenz auf jedem Einzelstrang. Elongation (72 °C): Die Taq-Polymerase verknüpft dNTPs komplementär zur Matrize und verlängert den Primer am 3′-Ende in 5′→3′-Richtung; es entstehen wieder Doppelstränge.
Erwartungshorizont zu Aufgabe b)
Enzyme sind Proteine; bei hohen Temperaturen lösen sich die Bindungen, die ihre räumliche Struktur halten, sie denaturieren und verlieren ihre Aktivität. Eine menschliche Polymerase wäre nach der ersten Denaturierung unbrauchbar und müsste in jedem Zyklus neu zugegeben werden. Die Taq-Polymerase stammt aus dem in heißen Quellen lebenden Bakterium Thermus aquaticus; sie übersteht wiederholtes Erhitzen auf 95 °C und hat ihr Optimum bei 72 °C. So können alle Zyklen ohne Eingriff automatisch ablaufen.
Erwartungshorizont zu Aufgabe c)
Geeignet sind P1 und P4. P1 ist identisch mit dem Anfang des gezeigten Strangs; er paart also mit dem Gegenstrang an dessen 3′-Ende und wird in Richtung Zielsequenz verlängert. P4 ist das umgekehrte Komplement des Endes (GGTACCTTAG → CTAAGGTACC); er paart antiparallel mit dem gezeigten Strang an dessen 3′-Ende und wird zurück in die Zielsequenz verlängert. P2 ist nur komplementär, aber nicht umgekehrt — er läge parallel zum Strang und kann nicht paaren. P3 paart zwar mit dem Gegenstrang, sein 3′-Ende zeigt aber aus der Zielsequenz heraus; die Polymerase würde nach außen verlängern.
Erwartungshorizont zu Aufgabe d)
Die Originalstränge dienen in jedem Zyklus als Matrize; die Kopien beginnen am Primer, laufen aber über das Ende der Zielsequenz hinaus (lange Produkte). Ihre Zahl wächst nur linear, um 2 pro Zyklus und Ausgangsdoppelstrang. Wird ein langes Produkt selbst kopiert, endet die Kopie am Ende der Matrize, also genau am anderen Primer: Es entstehen Stränge exakter Länge, ab dem dritten Zyklus auch vollständige Zielfragmente. Diese werden in jedem Zyklus verdoppelt. Nach 30 Zyklen stehen \(2^{30} - 60 \approx 1{,}07 \cdot 10^9\) Zielfragmenten nur 60 nicht exakte Doppelstränge je Ausgangsmolekül gegenüber.
Tuberkulose-Erreger nachweisen
AFB II–IIITuberkulose wird durch Bakterien verursacht, die sich in Kultur nur sehr langsam vermehren. Deshalb weisen Labore ihre DNA in Proben aus der Lunge (Sputum) mit einer Echtzeit-PCR nach: Ein Fluoreszenzfarbstoff lagert sich an doppelsträngige DNA an, und das Gerät misst nach jedem Zyklus die Fluoreszenz, die proportional zur DNA-Menge ist (M3). Als Maß für die Ausgangsmenge dient der Ct-Wert (M4).
| Zyklus | Probe A | Probe B |
|---|---|---|
| 10 | 0,00 | 0,00 |
| 14 | 0,02 | 0,00 |
| 18 | 0,20 | 0,01 |
| 22 | 0,80 | 0,11 |
| 26 | 0,98 | 0,67 |
| 30 | 1,00 | 0,97 |
| 34 | 1,00 | 1,00 |
| 38 | 1,00 | 1,00 |
Der Ct-Wert (von engl. threshold cycle) ist der Zyklus, in dem die Fluoreszenz einen festgelegten Schwellenwert überschreitet — hier 0,20. Gemessen wurden: Probe A Ct = 18, Probe B Ct = 23, Probe C (anderer Patient) kein Anstieg bis Zyklus 40.
- Beschreiben Sie den Verlauf der Fluoreszenz für beide Proben (M3).
- Erklären Sie den Kurvenverlauf und die Verschiebung zwischen den Proben.
- Ermitteln Sie, um welchen Faktor sich die Zahl der Erreger-DNA-Moleküle in den Proben A und B zu Beginn unterschied (M4).
- Ein Arzt folgert aus Probe C: „Der Patient ist sicher nicht mit Tuberkulose infiziert.“ Beurteilen Sie diese Aussage.
Hinweise
Hinweis zu Aufgabe a)
Hinweis zu Aufgabe b)
Hinweis zu Aufgabe c)
Hinweis zu Aufgabe d)
Erwartungshorizont
Erwartungshorizont zu Aufgabe a)
Bei beiden Proben ist die Fluoreszenz zunächst kaum messbar (A bis etwa Zyklus 14, B bis etwa Zyklus 18). Dann steigt sie steil an (A zwischen Zyklus 14 und 26, B zwischen 18 und 30) und nähert sich schließlich einem Plateau nahe 1 (A ab etwa Zyklus 26, B ab etwa 30). Die Kurve von B verläuft wie die von A, ist aber um einige Zyklen nach rechts verschoben; beide erreichen dasselbe Plateau.
Erwartungshorizont zu Aufgabe b)
Die DNA-Menge verdoppelt sich idealerweise pro Zyklus; anfangs ist sie aber so klein, dass die Fluoreszenz unter der Nachweisgrenze liegt. Durch das exponentielle Wachstum wird sie nach einigen Zyklen messbar und steigt dann steil. Das Plateau entsteht, weil Primer und dNTPs verbraucht werden, die Polymerase an Aktivität verliert und die vielen Produktstränge wieder miteinander paaren statt mit Primern. Probe B enthielt weniger Ausgangs-DNA; sie braucht mehr Verdopplungen, um dieselbe Menge zu erreichen, daher ist ihre Kurve nach rechts verschoben.
Erwartungshorizont zu Aufgabe c)
Probe B erreicht den Schwellenwert 5 Zyklen später als Probe A (23 − 18 = 5). Bei Verdopplung pro Zyklus enthielt A also \(2^5 = 32\)-mal so viele DNA-Moleküle der Zielsequenz wie B. (Voraussetzung: gleiche Effizienz der PCR in beiden Proben.)
Erwartungshorizont zu Aufgabe d)
Die Aussage ist zu stark. Ein fehlender Anstieg bedeutet nur, dass in der untersuchten Probe keine nachweisbare Menge der Zielsequenz vorlag. Mögliche Gründe für ein falsch negatives Ergebnis: Die Probe enthielt zu wenige Erreger (Erreger z. B. nicht im abgehusteten Material), die Probennahme oder DNA-Isolierung war fehlerhaft, Hemmstoffe im Sputum blockierten die Polymerase, oder eine Mutation an der Primer-Bindestelle verhindert die Anlagerung. Dagegen schützt eine Positivkontrolle bzw. interne Kontrolle im Ansatz. Die Aussage „nicht nachweisbar“ ist zulässig; eine Infektion schließt man erst mit Wiederholung, weiteren Proben und klinischem Befund weitgehend aus.